液体活检是与传统的组织活检相对应的概念，是以血液等非固态生物组织为标本进行取样和分析的体外诊断技术。

广义液体活检的概念，是指利用人体体液作为样本来源检测获取相关疾病信息的技术，体液包含血液、粪便、唾液等，可分别检测肺癌、前列腺癌和中枢神经系统肿瘤疾病等。狭义液体活检，也就是通常所说的液体活检一般是指通过检测血液中的CTC（循环肿瘤细胞，CirculatingTumorCell）和ctDNA（循环肿瘤DNA,CirculatingTumorDNA）获取患者肿瘤病变信息，用以帮助诊断治疗。

与传统的组织活检相比，液体活检的优势在于能够反映病灶的综合信息；除此之外，还有如下优点：

1、副作用小，风险小，操作简便。

2、可多次重复取样。

3、有效应对肿瘤异质性。

4、发现早于影像学检测。

5、成本低。

由此，液体活检技术被科技综述杂志《MIT Technology Review》评为“2015年度十大突破技术之一”。

据斯坦福大学医学院的助理教授Max Diehn介绍，就传统的癌症标志物而言，首要解决的问题是特异性。“对于之前探索的大多数生物标志物，正常细胞也会产生，因此并不是肿瘤细胞所独有的。这意味着，它们往往不是很特异。”液体活检则通过搜索血液及其他体液中更加特异的肿瘤指纹，来克服这方面的缺陷。这些指纹主要有两种形式：循环肿瘤细胞（CTC），从肿瘤上脱落的活细胞，代表着可转移的种子；循环肿瘤DNA（ctDNA），则是来自死细胞的遗传物质，通常以DNA短片段的形式存在。

1、CTC技术：循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）是游离于血液循环系统中的肿瘤细胞，来源于原发肿瘤组织，是肿瘤细胞转移的重要方式，是复发和激发癌症致死机制的重要因素。CTC作为肿瘤细胞，不仅包含肿瘤的DNA信息，同时还包含基因组、蛋白质组等信息，是研究肿瘤组织信息的丰富来源。

2、cfDNA/ctDNA技术：游离DNA（Cell-free DNA，cfDNA）是游离于血液循环系统中的来自细胞的DNA片段，主要来自于细胞凋亡进程中片段化的DNA、坏死细胞的DNA碎片、细胞分泌的外泌体。cfDNA中最重要的一类是循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA，ctDNA），ctDNA是进入血液循环系统中的来自肿瘤基因组的DNA片段，携带了突变、插入、缺失、重排、拷贝数异常和/或甲基化等基因信息。

一、循环肿瘤细胞（CTC）技术

循环肿瘤细胞技术主要由富集和检测分析两个步骤组成。

1、富集方法

CTC的富集方法主要有免疫亲和捕获法和物理特性富集法。

1.1 免疫亲和捕获法

免疫捕获法的原理是将特异性抗原包被在磁珠上制成免疫磁珠，再与靶细胞上抗原结合成“靶细胞—抗原抗体—磁珠”复合物，在磁场作用下向定向移动，从而富集靶细胞。

免疫捕获法又分为阳性富集，阴性富集和流式细胞术三种方法。

1.1.1 阳性富集

使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠，细胞与磁珠结合后直接在磁场中被分离出来。

优点：捕获的CTC纯度较高；能够捕获到血液中上皮型、上皮间质混合型的CTC。

缺点：无法捕获到间质型CTC（EpCAM阴性）。

1.1.2 阴性富集

用特异性抗体CD45，CD14 等与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞，CTC被富集沉淀。

优点：可检出EpCAM、CK阴性的间质型CTC。

缺点：样本处理步骤多，CTC易丢失。

1.1.3 流式细胞术

根据白细胞表达CD45抗原、CK阳性CTCs表达EpCAM，采用不同荧光素标记的抗CD45和抗EpCAM，通过流式细胞术分析和分选CK阳性细胞的CTC。

优点：可在检测的同时进行细胞形态、DNA倍数分析。

缺点：敏感性较低，需要的血液样本量大，缺乏规范的临床操作方法。

1.2 物理特性富集法

1.2.1 滤膜法

根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTC。

优点：分离后细胞完整性好；可完全分离上皮型、间质型CTC；可检出循环肿瘤拴子。

缺点：不宜检出细胞直径小于8um的肿瘤如神经内分泌瘤。

1.2.2 密度梯度离心

密度梯度离心法是根据肿瘤细胞与白细胞密度不同，通过梯度离心分离CTC。

优点：可分离CK阳性和阴性细胞。

缺点：CTC迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞层而丢失；CTC微栓子可能沉入红细胞层而丢失；与肿瘤细胞特性、离心时间和温度等有关；用血量多，一般需要15~30ml血。

2、检测分析方法

富集到CTC后，接下来还需要结合有效的下游分析方法。其目的有二：一方面，减少CTC数目判定的假阳性率和假阴性率；另一方面，通过对CTC表面标志物检测，能够反应肿瘤发生发展的动态变化，是研究肿瘤发生发展机制的有效策略，并能很好地指导临床治疗。

常用的检测分析技术有免疫荧光、荧光原位杂交、逆转录PCR及基因测序等。

2.1 免疫荧光法（IF）：借助免疫荧光染色，可对来自实体瘤CTC中的瘤标进行识别，从而达到检测CTC的目的。这也是目前检测CTC的最常见方法。

缺点是：在CTC形成过程的间质化阶段，大量的CK会降解，从而在CTC检测过程中出现假阴性。

2.2 荧光原位杂交（FISH）：是根据已知细胞内特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与细胞内的基因组中DNA分子杂交，检测该特异基因序列的存在与丰度。FISH技术与CTC结合，不仅可以检测CTC表面标志物，也可以检测CTC细胞内部的标志物及核型等。

2.3 逆转录PCR：提取组织或细胞中的mRNA作为模板，逆转录成cDNA。再对其进行PCR扩增，进而获得目的基因或检测基因表达。

优点：逆转录PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。结合RT-PCR可同时对若干个基因的表达进行检测。位点特异性PCR技术可用于检测CTC携带的驱动基因的突变情况。

2.4 二代基因测序：CTC数量少，直接进行二代测序难度大。需要将单细胞的DNA扩增后，再利用二代测序检查基因序列。

缺点：目前单细胞测序的技术仅仅停留在实验室阶段，未来向市场推广还有很长的路要走。而且由于肿瘤细胞的异质性，单细胞测序是否有代表性还需要更多的科学研究来证明。

二、循环肿瘤DNA（ctDNA）技术

ctDNA的检测流程大致分为四步：采血、离心获得血浆、从血浆中提取游离DNA和下游分析。

1、ctDNA的提取

目前常用于分离ctDNA的方法有离心柱法和磁珠法。

1.1 离心柱法

以硅胶滤膜作为固相载体，利用二氧化硅选择性结合DNA的独特属性开展分离。其原理是在高盐条件下，钠离子可破坏水中的氢与硅中带负电荷的氧之间的氢键，通过大量漂洗去掉所有杂物后，用缓冲液或蒸馏水在低离子强度下洗脱纯化的DNA。

1.2 磁珠法

带有磁荷的颗粒表面使用包被活性基团的氧化铁颗粒处理制成磁珠。核酸与这些活性基团之间可产生特异性吸附。因磁珠比表面积大，结合核酸的能力较强，可作为较好的分离载体。磁珠分离技术是现今核酸纯化的一种简单快速的方法。

2、下游分析技术

目前ctDNA的下游检测方法，主要有以下：

2.1 突变阻滞扩增系统（ARMS）技术

目前我国法规明确批准的血检方法、临床应用中相对普及、在EGFR已知突变的检测上优势明显。

缺点：检测范围局限于已知突变，且敏感度仅为70％。

2.2新一代基因测序（NGS）技术

目前最热门的基因检测技术，在多通道平行检测和发现未知突变上独具优势，

缺点：存在技术和成本的瓶颈，实验室水平差异较大。缺乏相关法规支持，距临床应用尚存距离。

2.3微滴式数字PCR （ddPCR）技术

近年发展起来的高灵敏度新技术，适用于已知突变的检测。ddPCR可用于特定突变的绝对定量检测，具有极高的敏感性，是目前ctDNA检测最稳定的技术。

缺点：该方法一次仅能检测少数突变位点，且不能检测融合变异，目前应用此技术进行ctDNA检测的试剂盒尚待开发中。

2.4 核酸质谱

可采用少量的样本一次完成多基因的检测，且其价格较NGS便宜，不需要复杂的生物信息分析。

缺点：通量较小，且不能完成绝对定量。

CTC与ctDNA技术横向比较

汇先医药通过自主研发的国际最领先的串并联式万通道多层微流控芯片，设计出一系列检验平台。该平台主要通过循环肿瘤细胞富集和检测系统，快速检测外周血肿瘤细胞PD-L1表达状态，从而作为临床重要的诊疗依据、并为医生提供用药指导。

汇先医药研发的系列检测试剂盒及仪器平台具有以下技术优势：

1、样本采用外周血作为来源，有效地补充了部分病患无组织可用、或不适宜进行穿刺的情况。

2、检测试剂盒采用原位检测分析，最大限度减少细胞转移损失，同时可改善染色效果，提高检测可靠性。

3、配套仪器采用全自动化设计，一键即可实现富集、固定、染色等全部过程；同时，仪器采用了多通道设计，一次操作可以并行检测多个样本。

汇先医药的检测产品可应用于个体化用药指导，特别是为难以获取组织样本的晚期癌症患者提供便捷、快速的血液监测试剂盒，从而为病人提供更为精准和个性化的检测结果，从而让医生可以制定出更为适合的治疗方案。